アガロース ゲル 濃度。 電気泳動用アガロース|遺伝子工学研究用試薬|ニッポンジーン

Nucleic Acid Electrophoresis Workflow—5 Main Steps

アガロース ゲル 濃度

電気浸透度が低いため、短い電気泳動距離でも良好な分離能が得られます。 1 Hinc II digest lane 2: 0. 5ug, lane 3: 0. 2ug, lane 4: 0. 1ug, lane 5: 0. 分解能は、アクリルアミドに匹敵し、200-1,000bpの範囲における分離可能なフラグメント差は、フラグメント全体長の約2%です。 ゲル強度に優れているため、取り扱いに大変便利です。 0~7. in-gel反応とバンドの切り出しにはTAEバッファーがより適しています。 バックグラウンドが低く、スメアにならず正確なバンドパターンを示します。 ゲル強度が高く取り扱いし易いので、ブロッティング用途に最適です。

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電気泳動試薬

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Q1 アガロースゲルとアクリルアミドゲルはどう使い分けるのか? A1 アガロースゲルはゲルの調製が簡単で、分離できる核酸サイズの範囲も広く便利です。 しかし、ゲル厚やゲル濃度を調節しても直鎖状DNAの1~2塩基の違いを検出できません。 アクリルアミドゲルはDNAサイズの分解能が良く1塩基の違いも検出でき、小さいサイズ(数塩基)から数kb程度のサイズの断片の泳動にも使用できます。 しかし、分離できるDNAサイズの範囲が狭いためサイズに合わせてゲル濃度を変える必要があります。 Q2 アガロースはどれを使っても同じなのか? A2 精製度の低い(安価な)アガロースは不純物を多く含み、特にDNAをアガロースゲルから回収する場合に、次の酵素反応を阻害する原因となります。 タカラバイオのPrimeGelシリーズ等のアガロースは高度に精製されており、不純物が慎重に取り除かれています。 さらに高度に精製されたDNAを回収する場合は、DNA回収用グレードのアガロース[、]の使用をお勧めします。 TAE BufferよりTBE Bufferを用いた方が、よりシャープなDNAバンドになります。 近接したDNAサイズを解析する場合、TBE Bufferを用いることにより、明確に分離することができます。 ただ、TAE BufferはTBE Bufferより緩衝力が低いため、長時間の泳動の際は時々バッファーを循環させたり陰極側と陽極側のバッファーを混合する操作が必要です。 どちらのバッファーを使用する場合でも、ゲル上に3~8 mm高のバッファー容量が必要で、少ないとゲルが乾燥してしまう危険性が高くなります。 一方、過剰量のバッファーは電気泳動槽の陰極と陽極の間の抵抗を下げ、その結果ゲルへの電圧勾配が下がり、DNAの移動度が遅くなります。 また過熱やDNAバンドのひずみを引き起こすこともあります。 Q4 DNAサンプルをアプライする時のローディングダイには何を使えば良いのか? A4 キシレンシアノールかBPB(ブロモフェノールブルー)を泳動サンプルに加え、電気泳動中にサンプルがゲルのどこまで泳動されているかを確認してください。 色素の移動度はゲルの濃度、アガロースの種類、泳動バッファーにより異なります。 各条件における色素の移動度はからご覧いただけます。 Q5 泳動後のゲルの染色には何を使えば良いのか? A5 エチジウムブロマイドは一般的なUVイルミネーターで観察でき、安価なため広く使われています。 は二本鎖DNAの、はRNAや一本鎖DNAの染色に使用でき、専用のフィルター(や光源)を用いることで高感度な検出が可能です。 サイズの小さな(約1 kb以下)DNA断片はモル数が同じでもDNA量が少ないため、染色後も薄く見づらくなりますが、SYBR Green Iは検出感度が高く、エチジウムブロマイド染色で見えなかった小さなDNA断片でも検出が可能です。 短い波長域の紫外線UVの照射は切断などのDNAダメージが大きいため、精製後クローニングをされる場合には長波長域の照射光源を持つイルミネーターを使用してください。 Q6 泳動後ゲルを染色する場合と、色素をゲルに入れておく場合の違いは何ですか? A6 泳動後染色すると、染色むらなく染まり、鮮明な泳動像が得られます。 また、染色液は数回使用できるため、ゲル数が多い場合には少ない色素量でゲルの染色をしていただけます。 泳動槽とゲルへ直接、色素を加える場合には、ゲルの調製時に色素を加えておく必要があり、均一な染色像も得られにくい欠点がありますが、染色時間を短縮できます。 SYBR Greenをあらかじめ加えたゲルを用いた場合、電気泳動後に染色する方法に比べ、感度が低下し、シャープなバンドになりません。 またDNAの移動度も異なるため、SYBR Greenをあらかじめ加えたゲルを用いて染色する方法はお勧めしません。 Q7 Mupidと大きな泳動槽のそれぞれの利点は? A7 Mupidなどの小型泳動装置は、短時間で泳動が終了しプラスミド、PCR産物の解析には機能的に十分です。 大きな泳動槽では、分解能がよくなり、電圧、電流の調節が可能となり泳動時間を容易に変えられます。 また、ゲルサイズが大きいため一度に多くのサンプルの解析を行えます。 Q8 染色液の廃液はどのように処理すればよいのか? A8 核酸の染色液は変異原性を持つものが多いため、そのまま排水として流さずに、廃液を市販の専用の吸着カラム[など]や活性炭に通し、色素を吸着処理後に廃棄してください。 活性炭の廃棄方法は、関連法令ならびに地方自治体の基準に従ってください。 トラブルシューティング Q1 サンプルをアガロースゲルのウェル(櫛穴)にうまくアプライできない。 A1 DNA溶液などはそのままでは比重が軽くウェルに入っていきません。 グリセロールの重みにより、泳動サンプルがウェルの中にゆっくりと沈んでいきます。 Q2 プラスミドを制限酵素処理した後、電気泳動すると数百bp付近に強い染色像が拡がってみられる。 これは何? A2 プラスミドと一緒に抽出されたRNA(主にrRNA)が、DNA調製時にRNase処理していない場合、数百bp付近にかなり濃い染色像として見られます。 これは、大腸菌への形質転換、制限酵素処理、PCR反応には影響はありません。 RNase Aをローディングバッファーに加えるか、プラスミドDNAをRNase Aで処理するとこの染色像はなくなります。 Q3 泳動中にゲルをみるとローディングダイが弓状になって泳動されている。 A3 高電圧下で電気泳動を行うと、ゲル全体の温度が不均一になり、ゲルの端部と中央で泳動度が異なるいわゆるスマイリング現象が起こります。 ゲル全体を冷却するか電圧を下げて泳動するとこの現象は起こりません。 Q4 泳動後ゲル写真を撮るとバンドがにじんだような泳動像がみえる。 A4 ウェルの中に気泡が入っていたり、完全にウェルがバッファーに浸っていない場合には、電気泳動後のバンドが不鮮明になります。 サンプルをアプライ後、ウェルが完全にバッファーに浸っていることを確認してください。

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アガロースゲル電気泳動の原理と方法

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この記事の内容• アガロース電気泳動の原理 アガロース(agarose)は、寒天生産性を有する海藻から抽出された中性多糖で、寒天のゲル化において大きな役割を担っています。 アガロースをバッファーに溶かして作成する アガロースゲルは、比較的大きな網目構造になり、より 小さな分子は早く移動することができます。 DNAなどの 核酸は負の電荷を持つので、アガロースゲルの片側に入れて電流を流すと、核酸は陽極に引き寄せられて移動します。 より具体的には2本鎖のDNAは、その塩基のlog10をとったものに反す比例した速度で流れます Helling et al. , 1974。 そのため、 核酸の大きさに応じて分離できるというのが電気泳動の大まかな原理です。 ちなみにタンパクはアクリアミドを使ったゲルで泳動します。 fa-arrow-circle-right関連記事 アガロースゲル電気泳動で準備するもの 泳動したいサンプルの他に準備するものとしてはこのようなものがあります。 泳動に使うバッファー アガロースゲル電気泳動には、専用の バッファー 緩衝液 が必要です。 例えば、バッファーではなく水を使ってゲルを作ってしまった場合、電気は流れず泳動できません。 反対に10倍濃いバッファーを使った場合には通常の電圧であってもたくさんの電気が流れ、泳動はすぐに終わってしまいます。 熱が発生し、最悪の場合事故につながる恐れもあります。 泳動バッファーには大きく TAE Tris-Acetate-EDTA , TBE Tris-Borate-EDTA , TPE Tris-Phosphate-EDTA の3種類があり、いずれもストック溶液を作成し室温保存し、必要な時に希釈して使用します。 これらは基本的にどれでもOKで、どれを使うかは好みによるところもあります。 細かい違いとしては、 TAEはTBEやTPEに比べてバッファーの劣化がしやすいという弱点があります。 緩衝能が落ち、陽極側のpHが酸性になっていきます。 見分け方としては、ローディングバッファー中のブロモフェノールブルーが黄色になりはじめた状態がpH 4. 6であり、バッファーの劣化が始まっています。 この状態になると作り直さなくてはいけません。 TBEやTPEはTAEよりも劣化しにくいものの、TAEより少しだけ高価です。 また、 2本鎖DNAはTAEで流した方がTBEやTPEよりもおよそ1割早く流れるので、特に高分子の解像度はTAEの方が上回ります。 このため長いDNAを解析するサザンブロットではTAEを使います。 反対に 短いDNAに関してはTBEの方が解像度が高いです。 よく使われる電気泳動バッファーをまとめました。 TAE 242 gのトリスに氷酢酸57. 1 mlと、0. 5 M EDTA pH 8. 0 100 mlを加え、MilliQで1 Lにメスアップして10xでストック ストックをMilliQで10倍に希釈して 1xで 使用。 最終的には40 mM Tris-acetate、1 mM EDTAになる TBE 54 gのトリスに27. 5 gのホウ酸と0. 5 M EDTA pH 8. 0 20 mlを加え、MilliQで1 Lにメスアップして5xでストック 10xでストックすると沈殿する ストックをMilliQで10倍に希釈して 0. 5xで 使用。 最終的には45 mM Tris-borate、1 mM EDTAになる TPE 108 gのトリスに15. 5 M EDTA pH 8. 0 を加え、MilliQで1 Lにメスアップして10xでストック ストックをMilliQで10倍に希釈して 1xで 使用。 TBEはバッファーとしての効果は0. TBEに含まれる ホウ酸が、次の生化学反応を阻害することもあることには注意が必要です。 リンク 泳動に使うゲル 大きく通常の アガロースゲルと low-meltingゲルの2種類がありますが、他にもintermediate melting ゲルやさまざまな種類のゲルがあります。 精製度の低い(安価な)アガロースは不純物を多く含み、特にDNAをアガロースゲルから回収する場合に、次の酵素反応を阻害する原因となりますが、 ただ検出したいだけの場合には安いアガロースでもいいでしょう。 それぞれのゲルの種類と濃度による分離能の目安はこちらです。 一般的には核酸を回収する目的に使われます。 それぞれのゲルの種類と濃度別の分離能 bp はこちらです。 Standard High-gel strengh Low-melting Low-viscosity, low-melting 0. 重りとしてはスクロースやグリセロールが使われ、色素としては ブロモフェノールブルー BPB や キシレンシアノール XC がよく使われて、これらを混合してバッファーを作ります。 BPBの方がXCよりもおよそ2. 4倍流れるのが早いです。 5x TBEで泳動した場合、 BPBはゲルの濃度によらずおよそ300 bpのDNAと同じ位置、XCはおよそ4 kbのDNAと同じ位置に来るので、今どのあたりなのか大体の目安にすることができます。 アガロースゲル電気泳動の手順 作り方を見ていきます。 アガロースの重さを量って三角フラスコに入れ、必要量のバッファーを加え、電子レンジにかけアガロースを溶かす。 溶液が 泡立たないよう、フラスコを机の上にそって回転させるように揺するのを、溶液が透明になるまで繰り返します。 三角フラスコにはゆるくサランラップをかけ、 小さな穴も開けておく 膨張した空気を逃がすため。 熱で水分が飛んでしまうので、溶かしたあとはバッファーが濃くなっていることに注意が必要。 レンジに掛ける前に重さを測っておき、溶けたあとにもう一度重さを測って、 熱でなくなってしまったバッファー中の水分と同じ量のMilliQを加えてバッファーの濃度をもとに戻す。 厚さは3-5 mm程度で、入り込んだ空気をとったあと、コームを差し込む。 室温で30分ほど放置し、固まったらゲルを電気泳動槽にセット 4. ゲルの上面5 mmくらいのところまで電気泳動バッファーを満たす。 泳動バッファーとゲルを作る時に使ったバッファーは同じものを使ってください。 ゲルローディングバッファーを加えたサンプルを、ウェルに入れる。 ゲルローディングバッファーの比重が高いのでサンプルは穴の底に沈むはず。 もし大きいゲルを使う場合には10 cmあたり10 - 50 V前後で泳動する。 これは低電圧であれば、DNAの泳動度は電圧にほぼ比例するものの、 高電圧だと特に高分子の泳動度が比例関係にならず解像度が落ちてしまうからです。 BPBやXCなどの色素を指標に、いいところで電気泳動を止める 30分前後。 ゲルにEtBrが入っていない場合には染色を行う。 そのタッパーをシェーカーに載せて軽く振とうしながら室温で30分ほど染色。 ゲルにもとからEtBrが入っているならこのステップは不要。 エチジウムブロマイド染色後の脱染色は通常は不要だが、もし10 ng未満のようなごく少量のDNAを見たい場合には、MilliQで室温20分ほどゲルを浸して脱染色し、結合しなかったエチジウムブロマイドを除くとバンドが見やすくなる。 SYBR Goldで染色する場合には泳動バッファーでSYBR Goldを10000倍希釈する。 トランスイルミネーターにサランラップを敷き、その上にゲルをのせてUVで照らす。 蛍光ものさしも一緒に写しておくといい。 通常は20000倍希釈して、つまり最終的に0. 核酸2. 5 bpごとに1エチジウムブロマイド分子がインターカレートします。 DNAとインターカレートしたエチジウムブロマイドは遊離のものに比べて蛍光が20-30倍強くなるので、 UVをゲルにあてることでDNAを検出できるという原理です。 標準的な0. 5 cm幅のバンドの場合、 エチジウムブロマイドを使った場合には2 ng程度まで見えます。 ちなみに1kbpのバンドの場合,これは100億分子相当です。 つまり 100億分子あってはじめて電気泳動で検出できるようになるということです。 逆にもし500 ng以上のDNAをアプライした場合、スマイリングやスメアなどになりきちんとバンドを見ることができないことにも注意です これは単一バンドの話で、いろいろな長さの混ざりものDNAであれば、20-30 ugくらいのせてもきちんと見えることがある。 EtBrは1本鎖も2本鎖核酸も検出できるが、1本鎖核酸へのアフィニティは低く、蛍光強度も弱いです。 実際1本鎖のDNAやRNAを検出する際は、分子内で部分的に2本鎖になっているところのシグナルをより強く反映しています。 もしアクリルアミドゲルを作る場合には、エチジウムブロマイドはアクリルアミドの重合を阻害してしまうので、前もってゲルにエチジウムブロマイドを入れておくことはできないことに注意です アクリルアミド電気泳動の場合には後でエチジウムブロマイド染色をする。 はEtBrよりも1000倍近く高感度です。 1本鎖RNAでも2本鎖DNAでも、中性ゲルでも変性条件でも使用することができ、 2本鎖DNAバンドなら20 pg、1本鎖DNAバンドなら100 pg, 1本鎖RNAバンドなら300 pgあれば検出できます。 SYBR Goldは泳動をゆがめてしまうので泳動前のゲルに入れておくことはできず、 後染めが必要です 原液を10000倍希釈 が、バンドを回収してエタノール沈殿をすれば沈殿には来ないので核酸からSYBR Goldを除けるし、SYBR Gold染色したゲルをそのまま膜に転写してサザンやノザンブロットをすることも可能です。 SYBR Goldは高価なので毎日使うわけにはいきませんが、放射能 RI を使う実験に迫る感度を出すことができます。 他にもSYBR Green Iは二本鎖DNAの、SYBR Green IIはRNAや一本鎖DNAの染色に使用できます。 リンク アガロースゲルからDNA抽出を簡易的に行う方法 DNA断片をゲルから回収するには, 低融点アガロースを用いてアガロースを溶かして回収する方法、NaIでアガロースを溶解する方法、DNAをガラスビーズに吸着させて回収する方法などいろいろあり、それぞれ特徴があります。 特殊な試薬を一切使わず、DNAを簡単にゲルから回収する方法をここでは解説します。 あまり長いDNAの回収に向かないという欠点はありますが、数100bpから数kbくらいまでのDNA断片の回収には十分です。 原理 原理として、ゲルを凍らせるとゲル中の水が結晶化し、ゲルがすかすかになります。 ここにフェノールを入れると、その部分にフェノールが入り込み、その結果フェノールよりも密度が大きくなり、遠心分離した場合はアガロースがフェノールの下に沈み、核酸を含む水層はフェノール層の上に追い出されてくるという原理です。 手順 1. 5mLのマイクロチューブの底に18Gの注射針で大きめの穴をあける。 フタも同様に空気穴をあける 縁が滑らかでないとゲルがひっかかるのでチューブの内側から外に向けて注射針を刺す 2. 穴のあいたマイクロチューブを新しいマイクロチューブの上に重ねる。 これを切り出すバンドの数だけ用意。 2段重ねができない遠心機の場合には、0. 5mlのチューブと組み合わせるといい。 DNAを電気泳動して必要なバンドをメスで切り出す 4. 2段重ねのマイクロチューブを8000rpm, 5分遠心 6. もしゲルが上に残っていたら追加で5分遠心 7. ゲルが全て下に落ちたら等量の平衡化中性フェノールを加え、フタをしてよく混合する 絶対にPCIを使ってはいけない 8. 室温で融解 フェノール中のDNAは変性温度T mが低くなっているので加熱は好ましくない 10. 15000rpm, 5分 11. 一番下にアガロース、その上にフェノール、その上に脱水不十分なアガロース、そしてその上に水層になる 12. 水層を新しいマイクロチューブに移す 13. およそ等量のPCIを加えvortex 14. 15000rpm, 5分 15. 水層を新しいマイクロチューブに移しエタノール沈殿する アガロースゲル電気泳動に失敗した時に確認すること うまく泳動できなかった時、これらの点をもう一度確認しましょう。 泳動バッファーの代わりに水を使用していないか アガロースゲル電気泳動では、泳動の際にTAE, TBE, TPEバッファーを使用します。 もし泳動バッファーの代わりに水を使った場合、全くバンドが見えません。 アガロース濃度は正しいか 目的のバンドに適していない間違ったアガロース濃度を使用すると、DNAバンドが見えないこともあります。 また、アガロース濃度が低いゲルを使用する場合は、ゲルが割れやすくなります。 ゲルは厚すぎないか 5mmよりも厚いゲルを使用すると、バンドがぼやけたり、染色のバックグラウンドが高くなる原因になります。 少ないとゲルが乾燥してしまう危険性が高くなります。 過剰量のバッファーは電気泳動槽の陰極と陽極の間の抵抗を下げ、その結果ゲルへの電圧勾配が下がり、DNAの移動度が遅くなります。 また過熱やDNAバンドのひずみを引き起こすこともあります。 DNAの量は適切か 少なすぎると検出できず、逆に多すぎるとバンドが歪んでしまいます。 DNAの構造は正しいか 環状 form I , ニックが入ったもの form II 、線状 form III で泳動速度が変わります。 それぞれのフォームの泳動速度は、使用したアガロースの種類や濃度だけでなく、電流の強さやバッファーのイオン濃度などにも影響をうけます。 目的のプラスミドが3 kbだからといって、マーカーの3 kbの場所に出るとは限りません。 プラスミドが環状で、マーカーが線状なら比較できないからです。 こういう場合は、 プラスミドを1箇所の制限酵素で切って線状にしたものを同時に並べて比べる必要があります。 サンプルの塩濃度は同じか 電気泳動するサンプルの塩濃度が異なると泳動パターンが乱れます。 例えば、サンプル1は制限酵素のHバッファーのような高塩濃度なのに、隣に並べたサンプル2は制限酵素のLバッファーのような低塩濃度だとゲル中の電場に乱れが生じます。 電極を付け間違えていないか 電気泳動装置の電極の+とーを間違えると、目的の方向とは逆に泳動されてしまいます。 関連サイト・図書 この記事に関連した内容を紹介しているサイトや本はこちらです。 がんをはじめとする病気やよくある症状などの 医学知識、再生医療などの 生命科学研究は、研究手法が大きく前進したこととコンピューターの発達なども相まって、 かつてないほどの勢いで知識の整備が進んでいます。 では、主として医師や医学生命科学研究者ではない方や、未来を担う学生さんに向けた情報発信をしています。 2週間に1回のペースで、サイトの更新情報や、それらをまとめた解説記事をニュースレターとして発行しています。 メールアドレスの登録は 無料で、もちろんいつでも解除することができます。 サイト名の「ハックする」には、分かってきたことを駆使し、それを応用して、病気の治療や研究などにさらに活用していこうという意味があります。 生命医学について徐々に解き明かされてきた人類の英知を受け取ってみませんか?.

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